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大发快三酸谈面对面丨猫大答疑第一期
发布时间:2020-02-25 12:46

  讲解老师:猫大 文字整理:尔悦 (山西医科大学站长) 审校:晶(山西校园站助手)

  分辨外泌体,主要是看它的形态。外泌体呢,它应该是直径在40到100nm左右的盘状的囊泡结构。所以,如果是在电镜照片上可以看到这样的结构的话,就是外泌体。

  然后,你给我的两张照片里面,我没有看到明显的外泌体结构,所以你可能没有分离到外泌体。而且我觉得你这个电镜照片,可能,制片的时候要再优化下条件,照片不太好看。

  问题2:用试剂盒法提外泌体怎么样拍出来的照片杂质会少一点,背景干净一点呢?

  抽外泌体呢,有很多种方法,比如说有超速离心法,有过滤离心法(旋转超滤混合仪初滤后再以不同孔径的滤膜逐级过滤),也可以做密度梯度离心、免疫磁珠法、PS亲和法,PEG-base沉淀法,也可以做色谱。一般,试剂盒用的是PEG沉淀的方法,这个方法,它抽出来外泌体的纯度肯定是不高的,然后会混有非常多的一个杂质。所以说呢,这种方法抽出来的外泌体,因为有方法的局限性了,所以你怎么样去处理它的背景都不会特别干净,要干净的话,就可以选择PS亲合法,或者是免疫磁珠法,或者是密度梯度离心法也是可以的。

  买回来的细胞株,或者是问别人要回来的细胞株,你首先要做的第一件事情就是要给它保种,给它多多的冻存起来。这样的话,传到一定代数之后,细胞长得不好了,那你就可以把之前保的低次代的细胞再给它复苏出来。这样的话你就可以不需要去购买新的细胞株了。

  像肿瘤细胞,它虽然是永生化细胞,但是也不能去无限制的传代,因为你会发现实际培养的时候,传着传着,细胞可能就会长得就不好了,形态就变了,所以呢,一定要切记,在细胞状态好的时候多多地保存一些“种子”。

  问题4:转染细胞被细菌污染,双抗已使用无效。因为培养周期长,解决方法除了重新培养外,还有没有其他方法可以把细菌除掉,而不干扰实验结果?

  其实不管是转染的细胞被细菌污染,还是普通培养的细胞被细菌污染,我都是不建议你去用抗生素给它处理掉细菌,然后再继续做实验。因为,被细菌污染之后细胞的状态,它的代谢和基因表达,都可能已经发生了一些无法预估的改变,那即使这时候把细菌给去除了,也很难保证说不影响你的实验结果,所以,细胞的污染,重在防御,不在治疗。

  那如果说,实在是没办法,这个细胞很珍贵。然后没有其他可以替代的,也没有更多的细胞保存着了。那可以去尝试其他的一些抗生素,什么庆大霉素之类的东西,处理一下细胞,看看能不能把细菌给抑制住,或者是把细菌给清除掉。

  问题5:求助,我已发现一个新的lncRNA_1,小鼠体内表型实验已完成(慢病毒pSico KD和OE lncRNA_1);进一步发现lncRNA_1激活NF-kB Luciferase,且与P65互作(使用RIP和RNA pull-down)。问题4-1.实验室没有与体内实验相对应的细胞系,下一步分子机制如何开展?先检测lncRNA_1是否促进P65磷酸化吗?

  如果是自己实验室没有合适的细胞株的话,就去查一下文献,看看别人是怎么得来的细胞株。你去问他们要或者是交换,或者是看他们是从哪边买的,自己也去买一个。如果就没有合适的细胞株的话,可以用原代细胞来代替。或者一些工具细胞,比如说293-T,如果它有合适的特性,比如说你想要研究的这个基因在293T细胞里有内源表达,那也可以拿来用。

  要找lncRNA参与NF-κB信号通路的机制,首先我觉得,你应该要把NF-κB信号通路搞清楚,哪些环节是影响到NF-κB信号活化发挥作用的,再一一排除lncRNA_1未参与的。

  NF-κB这条通路,我觉得它还是有点复杂的。然后我大致了解一下,我觉得你需要考虑的是:

  1、这个lncRNA是否会影响到NF-κB的一些亚基蛋白的二聚化.因为NF-κB家族由P50、P52、REL、REL-A(P65)、REL-B组成,这些蛋白二聚化之后,才能够形成有功能的NF-κB。所以你第一个要考虑的是这个lncRNA是否会影响到这些蛋白的二聚化。

  2、大部分的NF-kB二聚体通过与细胞中的三个抑制因子(IκBα,IκBβ,IκBε)的其中之一结合,然后以无活性的状态存在。因此第二个需要考虑的是,这些抑制因子是不是会与lncRNA发生相互作用,然后影响到NF-κB的活性。

  3、这些抑制因子(IκBα,IκBβ,IκBε),也会阻止它结合的二聚体与DNA的结合,并且通过这些抑制因子末端的输出序列(即核输出信号),可能会促进二聚体的出核作用,这个抑制因子主要是IκBα。因为NF-κB是一个转录因子,它要发生核转位,才会介导基因转录,所以你要考虑到NF-κB的核转位是不是会受到lncRNA的影响。

  4、NF-κB是转录因子,它与DNA结合才能发挥作用,所以你还要考虑到lncRNA是否会影响到NF-κB与DNA的结合。

  5、lncRNA是否会影响到NF-κB的转录活性。比如NF-κB可以通过一些自身的修饰,影响到自身的转录激活,所以你要考虑到这个lncRNA是否会影响到NF-κB蛋白上的修饰,比如说你提到的磷酸化修饰,还有其他的一些修饰:泛素化( Ubiquitination)、类泛素化修饰(SUMOylation)等。此外,也有可能会与蛋白降解有关,所以就要考虑lncRNA是否会影响到蛋白降解,如果蛋白降解了,那么它肯定也是会影响到NF-κB的转录活性。

  然后你的实验设计我感觉只看到了正反,没有看到正反正。正反正的话,你先给它过表达,然后给它干扰,然后你还得给它过表达一个东西,这才能是一个正反正吧,这才能算一个完整的rescue。

  问题6:在miR-1的promoter区预测了15个转录因子TFs,两种方法取交集(jaspar ∩PROMO),这些转录因子中超过1/2都可能与表型相关,请问如何选择目标TF进行试验验证?

  我觉得问题表述的不是太清楚,因为miR很难说它是直接跟表型相关,因为它是个调控性的东西,它会去调控到一些基因的表达,然后这些基因的表达可能是与表型相关的。

  如果说是转录因子调控了miR-1,然后miR-1又调控了表型相关的基因,那现在就是想找调控miR-1转录的转录因子。首先呢,你得找到相关性,就是说,这些转录因子跟miR-1的表达是真的相关,那可以去订购这些转录因子的siRNA,干扰这些转录因子的表达,检测miR的表达。那确定是哪个转录因子相关之后就可以去做报告基因实验,EMSA,CHIP这些实验去验证。

  那如果说是这些转录因子,同时调控了miR和表型相关的基因,然后这个miR还调控了部分的表型相关的基因,那这个课题可能就比较复杂,容易说不清楚。所以我就建议你再好好想一想,这三者之间的关系。然后再决定这个课题到底怎么进行下去。

  问题7:NIH unit,IU,U,这三个单位之间怎么换算,目前查到的文献也是五花八门。

  个人认为是不能进行一个简单的换算的,比如说NIH units,我查到一个Sigma的凝血酶,这个凝血酶活性是用NIH units来表示的,那它是怎么测出来的呢,它是直接与NIH凝血酶参考标准品比较而得到的NIH unit单位表示的活性,所以我觉得,不同的单位可能是通过不同的标准品,而且还可能是用了不同的实验方法来得到的,所以你很难去进行一个简单的换算。

  然后有一些公司,可能就比较良心,它可能就是各种都测了一遍,比如说Sigma,它会有一个技术文档,它会告诉你这个产品的NIH unit、IU或者U之间,它是怎么样的换算比例,但是不同的产品,可能换算比例是不同的。

  然后需要考虑的是,就算是同样都是凝血酶,使用了NIH凝血酶参考标准品去进行的比较得到了一个产品的NIH units。但是,可能不同批次的标准品出来的活性也是不一样的。所以很难说去进行一个简单的换算。

  问题8:用试剂盒提取外泌体会影响到外泌体的活性吗,比如PEG沉淀法,我们想提取之后再打回动物体内。

  因为用PEG沉淀法,然后或者试剂盒抽提外泌体,因为试剂盒基本上也是用的PEG沉淀法,这样得到的外泌体不纯的。我建议可以尝试用PS亲和法,因为这个方法得到的外泌体,是比较纯的,然后,它是利用PS,就是磷脂酰丝氨酸,把PS跟磁珠结合,利用亲和的原理去捕获外泌体囊泡膜上面的PS。所以这个方法,它跟免疫磁珠法相似,得到得外泌体形态是比较完整的,纯度是比较高的,而且因为不使用变性剂,不影响到外泌体的生物活性的,这样的外泌体可以用来去打动物。因为如果是变性的话,肯定会破坏掉亲和的一个结合。所以它是不使用变性剂的。用试剂盒抽的,我还是不太建议去打动物,因为里面混的杂蛋白太多了,可能会引起非常多的不必要的免疫反应。

  问题9:腺病毒与腺相关病毒怎么制备?从载体设计到操作包病毒以及病毒的使用原则。

  这个问题非常的大,那我就只能简单的说一下。病毒包装很简单,有一套病毒包装载体就可以。一般是有一个主要的质粒——骨架质粒,和几个辅助质粒。那你的基因呢,是装到骨架质粒上面去的。然后在包病毒的时候呢,把装好基因的骨架质粒和几个辅助质粒按比例混合转染包装细胞,一般转293T细胞或者转293也行。

  一般病毒颗粒会存在细胞培养上清里面,所以你可以把细胞培养上清收集起来,然后做病毒的浓缩、或者是纯化,或者是如果滴度够的话,直接去感染目的细胞就可以了。

  那病毒载体的设计呢,这个不用你设计啊,因为有专门研究病毒载体的人已经帮你把载体设计好了,你只要去拿到这么一整套系统直接用就行,去问商业公司购买,或者是问其他实验室去要,然后把你的目的基因装到骨架质粒里面就按照一定比例去进行转染细胞包病毒就可以了。这病毒使用原则,首先你要先算一下MOI值,按照合适的MOI值去感染细胞。简单来说,MOI值就是,你扔下去的病毒颗粒,这么多病毒颗粒,每个细胞能够分到多少个,然后每个细胞分到这么多病毒颗粒之后,能够达到一个非常好的一个感染的效果(具体做法就是数好细胞铺板,把病毒液做梯度稀释后去感染细胞,这样就能很清楚的知道每个孔多少细胞,每个孔加了多少病毒颗粒进去,观察一下要达到不错的感染效果最少需要用多少病毒,把这个孔的病毒颗粒数/细胞数就得到最合适的MOI值)。

  然后就是要注意一下安全操作,至少需要在二级的生物安全柜里进行病毒操作。然后接触病毒的废液、固体废弃物,都要用含氯的消毒液进行浸泡之后再丢弃。注意安全,否则有可能会引起又一次类似非典的大恐慌。

  问题10:我是科研小白,我的问题是QPCR实验原理,注意事项,怎么选择QPCR引物?

  你这个问题非常非常非常大哦,我在酸谈实验室花了好几节课才把这整个问题讲完,所以其实我建议你去看一下我的课,真的,酸谈实验室里面的课,详细讲了QPCR的原理, QPCR的整个操作流程是什么样子的,我推荐了一些试剂。你可以直接去购买这些试剂来用,然后QPCR的引物设计,引物的评价我全部都说了,我真的建议你去看一下这个课。

  免疫沉淀实验呢,我在酸谈实验室也都讲过,细节也都讲过,那这些细节我大概总结了一下,主要有:

  那像这种IP实验它的实验图片的解读呢,是要看具体的情况,最简单的就是证明两个蛋白有结合,那么A蛋白的抗体去IP,用B蛋白的抗体去做western,应该是可以看到B蛋白的条带。那说明A和B是有结合的,那当然你不能证明它是直接结合,因为它们俩可能中间有小三,小四,小五一堆都结合到一起。但是通常情况可能并不是去简单的证明两个蛋白有结合,那就需要针对该文章想讲的故事去具体的解读。

  问题12:加药后通过CCK8测细胞受抑制情况和普通CCK8测增值情况之间需要注意那些问题?

  实验操作区别是不大的,就是把细胞给它铺96孔板,然后把它培养到一定时间,要测的时候给它把旧的培养基去掉,加上含CCK8的新的培养基,然后再继续培养一段时间,再去上酶标仪检测。只不过加药的细胞,为了避免药物干扰的结果呢,需要在加含CCK8的培养基之前呢,最好洗一下细胞,避免药物干扰结果。另外就是加药时间的选择,加药浓度选择,然后,加药后检测时间点的选择也是需要注意的。

  比如说我们一般做细胞增殖的话,比如说我们有三个组,一个control组,一个no treatcontrol组,还有一个实验组的话,一般设五到六个时间点,然后分别取时间点去测就好了。

  但是加药,比如说你是要看加药时间的选择,那你就要先铺细胞,然后用药物处理不同的时间,然后再去测CCK8。

  那如果需要去做加药浓度的选择的话,你就设置不同的加药浓度,然后每一组加上不同药物浓度,去处理之后,再去做CCK8检测。

  CCK8实验原理是很简单的,实验方法也很简单,就是,主要是看你想讲一个什么故事,要做一些相应的变化。

  问题13:RNA甲基化是主要针对于DNA氧化损伤还是RNA氧化损伤的损伤反应?

  那第二呢,你需要明白,RNA甲基化呢,是RNA上的一些修饰,所以跟DNA没啥太大直接的关系。

  那第三需要明白的是,不一定说是RNA损伤了,RNA上才发生这个修饰。RNA甲基化修饰它其实是RNA上面的常态化的修饰,虽然它是动态变化的。所以说一条正经的RNA,它就应该有些修饰。

  不过我看到有报道说RNA甲基化修饰,它是跟DNA损伤的修复有关,它这个报道说,在紫外线所致的DNA损伤反应过程中呢,m6A甲基化修饰的RNA会迅速地在DNA损伤位点聚集,促进损伤修复,那这个过程,是有一个甲基转移酶和一个去甲基转移酶共同调控的。那当甲基转移酶的催化活性被抑制之后呢,细胞的修复的过程就会变得非常的迟缓,然后DNA的损伤就可能要很久才能被修复,甚至不能被修复,保证细胞对紫外线的照射更加敏感。那如果是过表达DNA聚合酶呢,就可以抑制这么一个RNA甲基转移酶的减少所导致的环丁烷嘧啶二聚体的聚集。

  所以呢,这整个故事咱们可以打个比方,就好比说一个人头上戴了顶帽子,这个帽子是个修饰,不一定说这个人就是秃头,他就是有缺陷,也有可能是因为这个人他要臭美啊,他要防晒啊,他要躲避警察追踪啊,各种原因。

  另外呢,你需要注意的是,RNA甲基化修饰它的类型是很多的,目前最热门的应该是有三种,分别是m6A RNA甲基化﹑m5C RNA甲基化﹑m1A RNA甲基化。

  问题14:针对于RNA甲基化的形成问题,我是否可假设为上游的转录因子或者通路蛋白,来介导RNA甲基化酶结合到RNA上?这种RBP结合作用的主流机制是什么?

  其实我建议你要读一些好杂志上的review,来快速了解一下新的知识,就不要自己瞎猜猜,就比如说何川教授,他在2017年发过一篇nature review,总结过m6A的一些相关的修饰,还有甲基转移酶复合体呀,去甲基化酶呀,然后一些相应的reader啊,这些协同调控RNA甲基化的分子。

  就我的理解来说呢,转录因子它是参与到DNA转录成RNA的过程的。它是在转录过程发挥作用的,它是跟DNA去结合的,但是RNA甲基化,它是发生在转录后的,这不在一个调控水平上。那如果你说非要说某个转录因子介导了甲基化修饰,也有可能,因为蛋白的功能经常就不是单一的。但是呢,你要这么说的话,一定需要非常详细具体的证明,如果证明出来,我相信会是一篇好文章,同理,我觉得你可以去好好了解一下细胞的信号通路是什么,在什么时候、哪个空间发挥作用,作用的后果是什么。

  关于RNA结合蛋白。你可以去看一下RNA结合蛋白的结构域。通常RBP蛋白呢,它是会有一个或者几个能够结合RNA的结构域在里面。所以呢,RBP才能够去结合RNA。

  问题15:RNA甲基化与DNA甲基化的研究有没有什么区别,具体的应该怎么去验证或关键实验有什么?

  RNA的甲基化和DNA的甲基化呢,因为它是发生在不同的物质上面的修饰,一个是RNA上面的修饰,一个是DNA上面的修饰,肯定是非常不同的。

  首先它们修饰的东西就不一样,一个是DNA,一个是RNA。那这两个东西,因为它其实是处在不同的基因表达进程中的,一个是DNA水平上,一个在RNA水平上,所以这样发生的修饰,主要影响的基因表达调控的水平也是不一样的,DNA上面的修饰,主要是会去影响到DNA向RNA转录,RNA上面的修饰呢,主要是会去影响到RNA向蛋白的翻译,所以第一点就很不一样。

  第二,因为是发生在不同的物质上面,那这个修饰,肯定不是说这个修饰就duang的一下就自己就掉到DNA上,或者是RNA上面的。比如说DNA修饰,它是有些DNA甲基转移酶,然后去甲基转移酶,还有一些什么PRC多梳家族蛋白啊,去协同调控DNA甲基化修饰的发生。RNA修饰也一样,它的RNA甲基化转移酶和去甲基转移酶,然后它的reader都是不同的。所以非常的不一样,包括它们的鉴定方法也很不一样,具体实验就自己去看文献吧,这边时间有限,就不多说了。

  问题15:脂溶性药物加入96孔板后 较高浓度的会出现结晶,这样真正的药效是否没有完全发挥出来,影响CCK8的实验结果?

  我觉得如果药物没有完全溶解的话,有可能说这个药物就没有去跟细胞完全地发挥作用,所以这时候测出来CCK8的值是不准的。所以我觉得你要么去用其他的方法,要么降低药物的浓度,让这个药物可以完全地溶解到培养基里面。

  问题16:在预测一个蛋白可能结合的miRNA时,TargetScan网站上会给出保守序列和非保守序列,这两类有什么区别呢,哪种更可能是目标miRNA,和其他网站取交集的时候用那种序列呢?

  在TargetScan上面确实是有保守和不保守两个库。那我觉得你首先还是看一下保守的库里面是不是可以筛到。如果是保守库里没有的话再去看不保守的,因为不保守的库就比较大。然后如果是保守和不保守的库,都有靶的话,最好还是都看一下,因为miRNA跟靶基因的结合,有可能并不是非常完美的,它有可能只需要几个碱基能够配上,它就可以去跟靶结合,然后去抑制靶mRNA的翻译啊,或者是什么样的一个过程,所以最好都看一下。

  当然,最后还是要看实验验证出来的结果,因为预测只是一个预测,只是基于计算的。而且,同一个miRNA在不同的细胞里面,出来的结果也可能是不同的。有可能别人说它在A细胞里面,测试出来这个miRNA跟一个目的基因可以结合,但是可能在B细胞里面就完全行不通了,所以需要,充分考虑到miRNA作用的机制,然后再去做这个实验,最后还是要实验验证为准。

  又用不同的PCR引物浓度(体积分别为0.8和1uL),分别做了一下,无论扩增还是溶解曲线,没啥变化。如下图:

  问题:我的这个U6茎环或者miR茎环,或者miR自身是不是就形成二聚体了?

  还有我说一下我的反转用的是takara的0037A试剂盒,按说明茎环稀释配成2uM,1号和2号管都按照说明书比例加的。

  我这个miR在用加尾法时,溶解曲线的基底部特别宽,大发快三而且跑组织时发现溶解曲线度,也就是扩增的产物都变了,不得已换的茎环法,可是茎环法pcr也是一塌糊涂。

  其实我觉得不在于说你用了茎环法还是用了加尾法,感觉这个熔解曲线都不太对劲儿,熔解曲线应该是比较sharp的一个峰。所以我感觉看你的熔解曲线都不对,所以要可能所有的步骤,所有的都要再去重新纠正一遍,包括前面RNA抽提的质量。然后另外呢,miR的反转的程序跟普通的反转程序是有一点点区别的,在酸谈实验室我给大家了一个我们实验室优化过的反转程序,你可以按照那个程序来。

  还有就是miRQPCR引物的设计,像u6、5s这种内参,其实没什么好说的,我在酸谈实验室也给过大家我用下来还比较好的引物序列了,然后miR引物呢,我建议你最好是要用,Oligo6,给引物做一下评价,如果你是手动设计,设计出来、评价下来不是特别好的话,其实你可以在引物的头上给它加几个碱基。这样可能会使引物的表现会更好,比如说你如果会写一些程序的话,我有一个我们实验室自己编写的小程序,是可以自动地加碱基,然后让引物表现更好的。

  但就是这个小程序它是没有一个可视化界面的,需要你要写些代码才能去设计引物,可能不会有一点点不太好用。

  然后我在酸谈实验室讲miR检测那节课的话是给大家推荐了一些miR引物设计的一些小软件,可以去看一下。

  除了问临床流调那些我不会的,我能回答的都尽量回答了。时间匆忙,可能回答得不能尽善尽美。大家可以来众妙书院或者知识星球向我提问。

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